Modération de l’émoi glutamatergique par disfonctionnement cholinergique là-dedans l’hippocampe des peptides stimulants des neurotransmetteurs cholinergiques de l’hippocampe de rat.

Toutes les expériences ont été réalisées remplaçant les directives ARRIVE.

les troupeau

Les expérimentations animales ont été approuvées par le Sauvage Care and Use Committee de la Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University (agréé n° 18149, 19-017H02) et sont normaux aux directives derrière l’habitude des troupeau de cabinet publiées par le nation nippon (loi n° 105, octobre 1973). La prolifération de souris homozygotes HCNP-pp KO et de souris témoins aplaties HCNP-pp a été réalisée comment favorable préalablement.36. Les troupeau ont été logés là-dedans des occasion particuliers exemptes d’agents pathogènes en tenant un vélo illumination/noirceur de 12 h (en tenant des connaissance allumées de 8h00 à 20h00) et ont eu autonome allée à la alimentation et à l’eau.

Nous-mêmes avons appliqué 176 lames de 80 souris mâles derrière des expériences électrophysiologiques derrière LTP (jouvenceau prolifération, 11-17 semaines ; pointé, n = 17, N = 10, HCNP-pp KO, n = 26, N = 10 ; prolifération pondéré, à quitter de 24 à 35 semaines d’âge ; un gîte voyeuse, n = 65, N = 28, HCNP-pp KO, n = 68, N = 32), et 20 souris femelles ont été utilisées derrière l’examiné Western blot (prolifération pondéré, 24-27 semaines , pointé, N = 5, HCNP-pp KO, N = 5 ; naïve prolifération, 54-55 semaines, pointé, N = 5, HCNP-pp KO, N = 5). Après, la frayage à douteuse irréflexion a été préparée à l’coadjuteur de diapositives d’échantillons sélectionnées utilisées là-dedans des expériences électrophysiologiques derrière LTP (jouvenceau prolifération, pointé n = 24, N = 5, HCNP-pp KO, n = 14, N = 5; prolifération pondéré, pointé, n = 41, N = 14, HCNP-pp KO, n = 38, N = 16).

Antigène

L’antitoxine polyclonal de lapin anti-souris/rat HCNP (HCNP-pp) a été engendré comment décrit préalablement.14. Après, l’antitoxine anti-HCNP-pp a été stérilisé en tenant une poteau d’ressemblance HCNP décidée à l’coadjuteur d’une poteau HP activée par Hitrap NHS (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA). Les antitoxine suivants ont été obtenus commercialement : antitoxine monoclonal anti-humain/rat (Abcam, Cambridge, État-Uni), protéine monoclonale post-synaptique anti-souris/rat 95 (PSD95) (Merck-Millipore, Billerica, MA, USA). ), humanisé/ antitoxine polyclonal de souris (Merck-Millipore), antitoxine polyclonal de lapin VAchT/SLC18A3 (NOVUS biology, Littleton, CO, USA), antitoxine polyclonal de lapin anti-humain/rat CHT-1 (Merck-Millipore), antitoxine monoclonal anti-β-actine (Sigma, St Paillette, MO, USA), observatoire polyclonal anti-humain/souris de lapin (Sigma), antitoxine polyclonal anti-souris NR-1 (Sigma), antitoxine polyclonal anti-souris et lapin NR-2A (Merck-Millipore) , antitoxine polyclonal anti-souris NR-2B (Merck-Millipore), antitoxine anti-souris/lapin anti-GluA1 humanisé (Merck-Millipore) et antitoxine polyclonal anti-souris (Merck-Millipore) GluA2/3 A Derrière les Western blots, antitoxine de lapin polyclonal anti-rat/rat (Merck-Millipore), antitoxine anti-RA conjugué à la HRP bbit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA), anti-souris (MP Biomedicals) ou antitoxine anti-RA IgG de échafaudage anti-chèvre (Abcam) comment antitoxine anicroche.

Amorcer les diapositives

Une flot a été décidée ultérieurement une agence précédente10,19. En chaussette, les souris ont été rapidement anesthésiées en tenant de l’halothane et décapitées. Les cerveaux ont été diligemment prélevés et des tranches d’hippocampe transversales de 400 μm d’largeur ont été préparées à l’coadjuteur d’une trancheuse vibrante (Linear Slicer Pro 7, Dosaka, Kyoto, Japon) là-dedans une terme glacée trousse (mM) : sucre, 260 ; KCL, 3 ; non2s4, 1,25 ; affreux3, 26 ; D-glucose, 10 ; et MgCl21 (pH 7,4), qui a été barboté en invariable en tenant 95% O2/ 5%k2. Une à quatre lames ont été obtenues à quitter de tout inintelligent et une recherche a été réalisée sur tout flot. Les tranches d’hippocampe ont été incubées pour 30 min là-dedans du limpide céphalo-rachidien affecté (ACSF) trousse (mM) : NaCl, 125 ; KCl, 2,5; Chez2, 2,4 ; MgCl2, 1 ; non2s4, 1,25 ; affreux3, 25 ; et D-glucose, 12,5, qui réalisait embouteillé en tenant 95% d’O2/ 5%k2 (pH ajusté à 7,4) à 32°C. Les lames ont été conservées à émotion ambiante (25 ± 1 ° C) là-dedans ACSF pour au moins 1 h jusqu’à ce qu’elles-mêmes soient prêtes derrière l’approbation.

Électrophysiologie

L’agence d’électrophysiologie a été réalisée remplaçant des besognes publiées préalablement10,19. En chaussette, les lames ont été fixées là-dedans une renfoncement d’approbation (dimension ~ 0, 4 ml, RC-26GLP, Warner Équipement, Hamden, CT, USA) inférieurement un chateaubriand de nylon attaché à une enraciné en métal incorruptible, avec immergées là-dedans l’eau et saturées en invariable. en tenant ACSF à un dette de 2 ml/min. Toutes les expériences ont été réalisées à émotion ambiante (25 ± 1 °C). Les fEPSP ont été enregistrés à quitter de la grand radioactive (SR) là-dedans le succession CA1 à l’coadjuteur d’électrodes en rasade borosilicaté (3–5 MΩ) remplies d’ACSF trempé. Les enregistrements ont été réalisés à l’coadjuteur d’un enceinte Axopatch 200B (Axon Équipement, Foster City, CA, USA) en tenant un cloison de échancrure assistant à 2 kHz.

Une cathode bipolaire en métal incorruptible (Buté Medical, Tokyo, Japon) a été organisée sur le SR, et les SC ont été stimulés en tenant une irréflexion de 0,1 ms toutes les 30 s. Originellement de tout maquette, une courbe stimulus-réponse a été générée et l’virulence du excitation a été agréable derrière décrire 30 à 50 % de la réplique maximale, ce qui correspond aux intensités de excitation de 20 à 40 A. Une potentialisation à spacieux résultat a été induite. là-dedans la diocèse CA1 de S-TS ou D-TS (persistance d’irréflexion 0,1 ms, 100 Hz pour 1 s) des SC. La excitation tétanique en D-TS a été effectuée à des intervalles de 2 secondes. Les fEPSP ont été enregistrés là-dedans CA1 pour 60 min ultérieurement l’ressemblance de la LTP. Après, la frayage à douteuse irréflexion a été préparée en appliquant une double de stimulations à des durées variables d’impulsions (25-200 ms).

indispensable de alcoolique

Les médicaments Prz et CCh ont été achetés là-dedans le office (Sigma). Intégraux les médicaments ont été coulé là-dedans ACSF et appliqués par des réservoirs de 60 ml alimentés par effet en tenant des bulles à 95% d’O.2–5 % k2 pour 10 minutes devant l’ressemblance LTP.

Énoncé Western blot

Western blot a été passé ultérieurement une agence précédente17. En chaussette, inférieurement narcose profonde au pentobarbital, tout souris a été anesthésiée en tenant une terme marais salant tamponnée au phosphate. Une jour les cerveaux retirés et placés sur de la iceberg, l’hippocampe a été disséqué et promptement congelé là-dedans de l’nitrogène limpide et stocké à -80 ° C jusqu’à habitude ultérieure. L’hippocampe congelé de cinq souris HCNP-pp KO et de cinq souris témoins a été homogénéisé là-dedans quatre volumes de cachet de lyse trousse 30 mM HCl (pH 8,5), 7 M miction, 2 M thiourée, 4 % w/v CHAPS et un répresseur de protéase casse-croûte (Afrique Applied Escient, Indianapolis, IND, USA). Subséquemment couvaison pour 60 min sur iceberg, les homogénats ont été centrifugés à 15 000× g pour 3 minutes à 4 °C. Une jour la teneur en protéines mesurée à l’coadjuteur du apprentissage de Bradford (Pierce, Rockford, IL, Factures-Unis), les surnageants ont été stockés à -80 ° C jusqu’à à eux habitude ultérieure. Après, 10 μg de tout parcelle de surnageant ont été chargés sur tout sentier là-dedans un gel à 10% derrière une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide. Subséquemment électrophorèse, les échantillons ont été transférés sur des membranes Hybond-P (GE Healthcare, Tokyo, Japon) en utilisant du Tris 25 mM, de la glycine 192 mM, du SDS à 0, 1% et du méthanol à 10% comment cachet de répartition. Après, les membranes ont été incubées en tenant un antitoxine polyclonal anti-ChAT de échafaudage 1:500, un antitoxine polyclonal anti-VAchT de lapin 1:5 000, un antitoxine polyclonal anti-CHT-1 de lapin 1:1 000, un antitoxine polyclonal anti-synaptophysine de lapin 1:200 000. , Antigène polyclonal de lapin anti-NR-1 1:2000, Antigène polyclonal de lapin anti-NR-2A 1:5000, Antigène anti-NR-2B 1:1000, Antigène anti-GluA1 de lapin 1:5000, Polyclonal de lapin 1:1 000 anti-GluA2/3, antitoxine monoclonal anti-PSD95 1:2 000, antitoxine polyclonal observatoire muscarinique 1 de lapin 1:2 000 ou antitoxine monoclonal anti-β-actine 1:50 000. Les membranes ont après été sondées en tenant des antitoxine IgG conjugués à de la peroxydase de raifort de lapin, des antitoxine IgG anti-souris ou anti-chèvre. Les bandes immunofluorescentes ont été visualisées à l’coadjuteur du kit de localisation ECL Advance Western Blotting (GE Healthcare, Tokyo, Japon) et enregistrées en tenant l’ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Tokyo, Japon). Les transferts Western ont été quantifiés à l’coadjuteur du plan d’examiné Amersham Rehausser 600 (GE Healthcare, Tokyo, Japon).

Disposition de occurrence et examiné catalogue

L’digitalisation des occurrence et l’examiné catalogue ont été effectués ultérieurement les besognes précédentes 10,19. En chaussette, toutes les occurrence ont été incluses là-dedans les analyses finales, à l’bizarrerie du siècle de révolution de réplique de ossature au pension de l’recherche. Les fEPSP ont été échantillonnés en ornement à 4 kHz (PowerLab, AD Équipement, Sydney, vierge), stockés sur un enregistrement dur et analysés sauvé ornement à l’coadjuteur de la groupe 4 et du plan 5 (AD Tools). Les aptitudes de inclinaison maximales de la étage de contrôlé capitale des fEPSP ont été mesurées derrière détourner beaucoup que barcasse la transmission des composants levant de la congestion. Le dimension de LTP a été maniéré en coefficient des aptitudes de inclinaison fEPSP moyennes 50 à 60 min ultérieurement tout excitation tétanique proportionnellement aux aptitudes de inclinaison fEPSP de ossature. Les paramètres dérivés (n = monde de lames, N = monde d’troupeau) ont été comparés à l’coadjuteur d’une examiné de variance directive, qui a été suivie de comparaisons pluraux (apprentissage de Tukey) ou d’un apprentissage t non apparié en tenant le stade de représentativité commandé à s< 0,05. Les bandes quantitatives là-dedans les transferts Western ont équitablement été calculées et comparées à l'coadjuteur d'un apprentissage t non apparié en tenant le stade de représentativité commandé às< 0,05. De alors, les paramètres et les traverses ont été exprimés en tellement que norme ± faute conforme de la norme.

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