Bain de pâturage et réactant
Le élément de progrès consistait en un élément Eagle dérangé par Dulbecco (Sigma-Aldrich, St.−7 M dexaméthasone (Sigma-Aldrich), sel de sodium hydraté de glycérol-2-phosphate 10 mM (Sigma-Aldrich), piquant ascorbique 200 μM (FUJIFILM Wako Suprême Chemical Corp., Ltd., Osaka, Japon). Une règle hydrosoluble de lansoprazole a été achetée malgré de Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japon). Étant donné que nous-même avons préalablement énergique que 20 μM de lansoprazole exerçaient l’fruit extrême avec normaliser Runx2 et la personnalisation ostéogénique terminale hormis cytotoxicité in vitro externe, nous-même avons adopté une attention conclusion de 20 μM pendant vaillance par détérioration de lansoprazole fondant chez cette enquête.
Civilisation cellulaire de cellules souches mésenchymateuses humaines disponibles chez le magasin
Des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de quintessence osseuse obligeante ont été achetées pendant Lonza (Bâle, Huissier) et cultivées chez un élément de progrès jusqu’au article 5. Le élément a été changé intégraux les trio jours. Pile raisonner une personnalisation ostéogénique in vitro, des cellules témoins ont été ensemencées chez quelque cavité de la affiche d’amorce à une brièveté cellulaire de 3 × 10.5 cellules/cm2 Ceux-là-ci ont été cultivés chez du élément ostéoformateur auxquels du lansoprazole fondant a été supplétif avec impétrer une attention conclusion de 20 µM (fois 0). Les cellules ont été traitées bruissement du lansoprazole fondant ballant un, trio ou cinq jours, perpétuel d’une pâturage chez un élément ostéogénique hormis lansoprazole jusqu’au 14ème fois. runx2 Les concentrations d’ARNm et d’ostéocalcine ont été mesurées chez les lysats cellulaires au fois 14.
Civilisation cellulaire de quintessence osseuse prélevée sur le malade
Conséquence à l’adhérence du séminaire d’écoute traditionnel et au ralliement éclairé grimoire d’un rejeton droitier en attentionnée complexion de 5 ans abouti de dysplasie et de ses soignants, 20 ml d’aspirat de quintessence osseuse ont été obtenus du malade au période de l’ostéotomie pelvienne reconstructive. Toutes les méthodes ont été réalisées remplaçant aux directives et réglementations en constance. Une fragment illustre en cellules mononucléaires a été extraite de l’confiance par séchage en gradient de brièveté bruissement un Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) et cultivée chez un élément de progrès (fois 0). Les cellules hématopoïétiques non adhérentes ont été consciencieusement éliminées par ablution continu les jours 3 et 6, et les cellules adhérentes en souple résultantes ont été séparées et réensemencées chez quelque cavité de la affiche d’amorce à une brièveté cellulaire de 1 × 10.4 cellules/cm2 Le septième fois. Une conflit des cellules détachées a été soumise à une dissection par cytométrie en coulée le même fois, et le prime a été aboutissement ostéogénique bruissement un élément ostéogénique étui 20 μM de lansoprazole fondant ballant 24 h, perpétuel d’une pâturage chez un élément ostéogénique libéré de lansoprazole. au fois 28. Les concentrations d’ostéocalcine ont été mesurées chez des solutions cellulaires au fois 21. Pile le posologie des nodules minéralisés, une teinte au Afrique alizarine a été réalisée au fois 28.
Allant ALP et posologie immuno-enzymatique de l’ostéocalcine
Les cellules ont été lavées un duo de jour bruissement une épilogue étang tamponnée au phosphate (PBS) et lysées chez du Triton X-100 à 1 % (Sigma-Aldrich). Les activités ALP chez les lysats cellulaires ont été déterminées par chromatographie en utilisant du ρ-nitrophényl phosphate (PNPP) pendant substrats. La teneur intacte en protéines des lysats cellulaires a été entreprenante par un kit d’dissection de protéines Pierce à 660 nm (Thermo Fisher Scientific) en utilisant de l’albumine de sang bovin pendant conforme. Les concentrations d’ostéocalcine ont été mesurées chez des lysats cellulaires en utilisant un kit EIA d’ostéocalcine obligeante sauvée (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), remplaçant aux instructions du confectionneur. L’passage ALP et la attention d’ostéocalcine ont été normalisées relativement à la teneur intacte en protéines de quelque épilogue.
Coloris au Afrique d’alizarine S.
Les cellules ont été lavées un duo de jour bruissement du PBS, fixées bruissement du paraformaldéhyde à 4 %, colorées bruissement une épilogue de Afrique d’alizarine S à 0,1 % (pH 6,3) ballant 20 min à paludisme ambiante et rincées trio jour bruissement de l’eau distillée. Des micrographies de cellules colorées ont été obtenues en utilisant un BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japon).
Énoncé par cytométrie en coulée
Puis ablution, les cellules ont été colorées bruissement méconnaissables combinaisons d’antitoxine monoclonaux, particulièrement l’anti-CD45 conjugué au bleusaille innocente, l’anti-CD90 conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l’anti-CD73 conjugué à l’allophycocyanine (APC), le CD105 conjugué à la phycoérythrine (PE) de Beckman Coulter (Fullerton, CA) et visé isotypique de BioLegend (SanDiego, CA). Les cellules colorées ont été analysées à l’possédant d’un chercheur MACSQuant (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne) et les conditions acquises ont été analysées à l’possédant du programme FlowJo (Tree Vedette, Inc., Ashland, OR).
Production d’os fabriqué fondant mouillé de lansoprazole
Nous-même avons assidu un tréteau β-TCP unidirectionnel énormément ouvert avec le greffage (bruissement la acceptation de Kuraray Co Ltd., Japon). Il a une hauteur de pores de 35 à 250 μm et une perméabilité de 57 ± 5 %. Ceux-là de règle trapézoïdale ont été immergés chez chaque personne des solutions de lansoprazole 20 μM, 200 μM ou 2 mM chez l’eau ballant trio minutes, plus rincés chez une épilogue PBS ballant une moment.
Modèle de détérioration d’os cortical de lapin
Intégraux les diététique et manipulations des troupeau ont été approuvés par le séminaire traditionnel de réconfort et d’maniement des troupeau et sont effectués remplaçant aux directives ARRIVE. Toutes les chirurgies ont été réalisées chez des opportunité stériles habituelles. Des lapins purs nippon âgés de 13 semaines (quasiment 2,5 kg de force physique) ont été anesthésiés bruissement des injections intramusculaires de kétamine et de xylazine avec une fluide preste et une fumigation d’isoflurane avec enchaîner l’assoupissement. La cuir, le aponévrose et le périoste dessus du tibia proximal ont été coupés des un duo de amas postérieurs à l’possédant d’un grossissant. Un détérioration décharné perpendiculaire pouvant recueillir un intérim décharné de 5 mm de abondant, 7 mm de étendu et 5 mm de aven a été construit chez le enveloppe antérolatéral du tibia proximal à l’possédant d’un dissous individualisé et d’un micro-attelle. Le détérioration a été rincé bruissement une épilogue étang aride avec détrôner les fétiche d’os cortical. Les échafaudages empiriques et de visé ont été de près ajustés au détérioration des amas postérieurs franc et grossière, respectivement. Le détérioration incarnait bâché de biceps et la cuir incarnait fermée en procréation. Les troupeau subsistaient libres de se destituer et de assumer à elles force instantanément ultérieurement la procédé, pendant ceci incarnait capable. Intégraux les lapins ont été sacrifiés et les jambiers proximaux des un duo de amas postérieurs ont été prélevés quatre semaines ultérieurement la opération.
Énoncé cytologique de l’os
Les échantillons d’os ont été déshydratés séquentiellement en utilisant de l’biocarburant à 70 %, de l’biocarburant à 90 % et de l’solvant. Les échantillons ont ultérieurement été enrobés hormis décalcification chez du méthacrylate de méthyle (MMA). Des sections mi-sagittales de six μm du tibia proximal ont été préparées bruissement un microtome et colorées bruissement la teinte de Villanueva-Goldner. Pile désapprouver la amélioration osseuse chez les matériaux ouvert, la plaine de l’os dernièrement formé qui a été brillant en astringent a été mathématiquement mesurée à l’possédant du programme d’dissection d’images informatisé WinROOF (Mitani Co Ltd, Japon), plus un duo de contraventions de plaine ont été déterminés, l’un incarnant la zinzin d’os dernièrement formé chez l’orchestre folklorique du équipement (plaine osseuse intacte, TBA) avec l’orchestre folklorique du équipement (plaine intacte du équipement, TMA), et une différent zinzin incarnait la zinzin d’os dernièrement formé chez la zinzin égoïste de le équipement intégré chez la zinzin d’os cortical (zinzin d’os critique, PBA) avec quelque zinzin égoïste du équipement conçu chez la zinzin d’os cortical (zinzin de sujet partielle, PMA). Celui-ci correspondance PBA/PMA a été assidu avec l’devis quantitative de la réparation enveloppe qui peut répercuter en conflit la habileté ostéoprotectrice des sujets.
Check-up radiographique
Des radiographies antérieures, postérieures et latérales de intégraux les tibias récoltés ont été prises à l’possédant d’un imageur de cinémathèque à rayons X brebis (Softex Co Ltd, Tokyo, Japon), et une stratigraphie micro-informatique (µ-CT) a été réalisée sur intégraux les tibias à l’possédant d’un inspeXio SMX-90CT Encore (Shimadzu). ) Co Ltd, Kyoto, Japon). Les images radiographiques et les images µ-CT ont été examinées avec trafiquer qualitativement sur la apprentissage de fibrille fibrogranulaire tout autour des substituts décharné et sur l’balance de résolution des matériaux.
analyses statistiques
Toutes les conditions sont présentées en deçà règle de norme et d’boucle principe (ET). Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’possédant d’IBM SPSS 28 Statistics (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les différences statistiques compris les un duo de coeurs ont été déterminées par les R-un écoute. Une ANOVA directive bruissement le preuve post hoc de Tukey a été appliquée avec conditionner s’il y avait des différences significatives compris les moyennes de trio coeurs indépendants ou encore. Nous-même avons évalué les réponses à la grandeur de lansoprazole à l’possédant du preuve de disposition de Jonckheere-Terpstra sur une décape de attention indiquée avec une épilogue de lansoprazole fondant. Le preuve de Jonckheere-Terpstra est un preuve non paramétrique de différences ordonnées qui détermine statistiquement la chemin des tenue dose-réponse. Actif que l’ANOVA directive cédé majoritairement des aptitudes encore strictes que le preuve Jonckheere-Terpstra bidirectionnel, l’ANOVA directive ne peut pas individu appliquée avec chérir les réponses à la grandeur. une sUne vaillance < 0,05 incarnait considérée pendant statistiquement animée.
Emprunt comclusion
Toutes les expériences sur les troupeau ont été réalisées remplaçant aux directives institutionnelles et ont été approuvées par le Séance traditionnel de réconfort et d’maniement des troupeau de l’Faculté de Nagoya. L’ablation de la quintessence osseuse a été approuvée par le séminaire d’écoute traditionnel de l’solarium professeur de Nagoya. Intégraux les aspirats de quintessence osseuse ont été prélevés de la cime coxal au balade de l’ostéotomie à l’perpétuel de Salter indiquée avec le solde de la dysplasie développementale de la fémur.